ΑΡΓΥΡΟΣ ΚΑΙ ΙΣΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑ: ΜΙΑ ΣΥΝΤΟΜΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ

Ευάγγελος Παντέρας 1 , Ζωή Λιάκου 2

1 Προπτυχιακός Φοιτητής, Τμήμα Κτηνιατρικής, Π.Θ., epanteras@uth.gr

2 Βιοχημικός- Βιοτεχνολόγος, MSc, PhD, Τμήμα Κτηνιατρικής, Π.Θ, zoiliakou@uth.gr

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Ο άργυρος είναι ένα μέταλλο το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως στον τομέα της ιστοπαθολογίας, γεγονός που αναδεικνύεται από το μεγάλο πλήθος τεχνικών που χρησιμοποιούνται, καθώς και από τις διαφορετικές περιπτώσεις στις οποίες αξιοποιείται. Για τον λόγο αυτό, το παρόν άρθρο αποπειράται να παράσχει στον αναγνώστη μία ολιστική εικόνα των χρώσεων αργύρου (silver stains), ταξινομώντας μερικές από τις κυριότερες σύμφωνα με τον μηχανισμό λειτουργίας τους και επεξηγώντας τις πρακτικές εφαρμογές τους, στα πλαίσια της διάγνωσης. Επιπλέον, για κάθε χρώση παρατίθενται ενδεικτικές φωτογραφίες με σκοπό την εξοικείωση του αναγνώστη με αυτές.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η Ιστοπαθολογία, χαρακτηρίζεται από την χρήση του οπτικού -ή και σε πολύ συγκεκριμένες περιπτώσεις, του ηλεκτρονικού- μικροσκοπίου για την αναζήτηση παθολογικών αλλοιώσεων στην υπερ-/υποκυτταρική δομή των προς μελέτη ιστών. Δεδομένου ότι τα κύτταρα του ανθρώπινου/ζωικού οργανισμού δεν χαρακτηρίζονται από ιδιαίτερη χρωματική ποικιλομορφία, οι ιστοπαθολόγοι χρησιμοποιούν ποικίλα πρωτόκολλα . Αυτά χρησιμοποιούνται για να χρωματίσουν με διαφορετικό τρόπο τα κυτταρικά και εξωκυτταρικά στοιχεία ενός δείγματος, έτσι ώστε αυτά να είναι πιο ευδιάκριτα κατά την μικροσκόπηση.

Τα εν λόγω πρωτόκολλα, αναφέρονται κοινώς ως “χρώσεις” και η ονομασία τους πηγάζει είτε από τα συστατικά τους (λ.χ. χρώση Αιματοξυλίνης – Εωσίνης), είτε από το όνομα του ερευνητή που τις εισήγαγε (λ.χ. Masson’s trichrome stain). Κάθε χρώση ενδείκνυται για την μελέτη ενός σαφώς ορισμένου εύρους παθολογικών καταστάσεων και επομένως είναι κρίσιμης σημασίας ο ιστοπαθολόγος να γνωρίζει ποια είναι η κατάλληλη χρώση για την εκάστοτε περίπτωση.

ΧΡΩΣΕΙΣ ΑΡΓΥΡΟΥ

Οι χρώσεις αργύρου είναι μία ομάδα χρώσεων, κοινό χαρακτηριστικό των οποίων είναι η χρήση του αργύρου ως κύρια χρωστική. Ο άργυρος αυτός καθαυτός, εναποτίθεται στο δείγμα με την μορφή ιόντων (Ag+ ) τα οποία έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν μεταλλικά σύμπλοκα μεταξύ τους, με αποτέλεσμα την εμφάνιση χαρακτηριστικού σκούρου καφέ προς μαύρου χρώματος. Τα ιόντα αργύρου έχουν “τροπισμό” προς μόρια με ισχυρά αναγωγικές ομάδες, προς συγκεκριμένες δομές που απορροφούν τέτοιου είδους ιόντα και όπως προαναφέρθηκε, προς άλλα ιόντα αργύρου (Grizzle, 1996).

Όπως είναι αναμενόμενο, τα πρωτόκολλα των χρώσεων αργύρου, δεν χρησιμοποιούν μόνο άργυρο αλλά και μία ποικιλία άλλων ουσιών, με σκοπό είτε να ενισχύσουν την πρόσδεση των ιόντων στις προαναφερθείσες δομές, είτε να λειτουργήσουν ως “counterstain” ώστε να είναι ορατές και οι δομές στις οποίες δεν προσδέθηκαν τα ιόντα αργύρου. Ανάλογα με τον χημικό μηχανισμό που αξιοποιείται κάθε φορά για την πρόσδεση των ιόντων, οι χρώσεις αργύρου διακρίνονται σε τέσσερις μεγάλες κατηγορίες, οι οποίες θα αναπτυχθούν ακολούθως.

1. ΧΡΩΣΕΙΣ ΑΡΓΕΝΤΑΦΦΙΝΗΣ

Οι αργενταφφινικές χρώσεις (Argentaffin stains) αποτελούν την πιο απλή κατηγορία των χρώσεων αργύρου. Βασίζονται στην περιεκτικότητα του (προς μελέτη) δείγματος σε μόρια με συγκεκριμένες χημικές ομάδες, οι οποίες μπορούν να ανάξουν τα ιόντα αργύρου σε μεταλλικό άργυρο (Grizzle, 1996).

Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η χρώση Fontana-Masson, η οποία χρησιμοποιείται για την εντόπιση εναποθέσεων μελανίνης, σε φυσιολογικά κύτταρα και σε καλοήθεις ή κακοήθεις νεοπλασίες (National Society for Histotechnology, 2021b). Η μελανίνη ανάγει τον αμμωνιακό νιτρικό άργυρο σε μεταλλικό άργυρο, χωρίς την παρουσία εξωτερικού αναγωγικού παράγοντα.

Επιπλέον, έχει αποδειχθεί πως η χρώση αυτή έχει διαγνωστική αξία στην διαφοροποίηση μυκήτων του γένους Cryptococcus από άλλες ζύμες, καθώς μόνο οι πρώτοι περιέχουν μελανίνη στο τοίχωμά τους (Wada et al., 2008). Το πρωτόκολλο της χρώσης, συνήθως περιέχει και μία χρωστική όπως η “nuclear fast red” ως counterstain.

Εικ. 1. Βιοψία προστάτη με χρώση Fontana-Masson. Στην εικόνα φαίνεται με σκούρο καφέ χρώμα το κυτταρικό τοίχωμα των Cryptococcus neoformans σε περίπτωση ασθενούς με κοκκιωματώδη προστατίτιδα (Wada et al., 2008).

2. ΑΡΓΥΡΟΦΙΛΙΚΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ

Στις αργυροφιλικές χρώσεις, τα ιόντα αργύρου ανάγονται προς μεταλλικό άργυρο, με την προσθήκη αναγωγικού παράγοντα. ο οποίος θα δώσει στα ιόντα αργύρου την ικανότητα να σχηματίσουν μεταλλικά σύμπλοκα (Grizzle, 1996).

Άξιο αναφοράς, για τη συγκεκριμένη κατηγορία χρώσεων, είναι το πρωτόκολλο AgNOR (Argyrophylic nucleolar organiser region), το οποίο ανιχνεύει τις επονομαζόμενες “περιοχές οργάνωσης του πυρηνίσκου” (Nucleolar Organizer Regions, NORs)”. Οι NORs συνιστούν πυρηνικά στοιχεία που περιέχουν αργυρόφιλες πρωτεΐνες (AgNOR πρωτεΐνες), και βάφονται επιλεκτικά με τις χρώσεις αργύρου (Trerè, 2000).

Ορισμένες μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε διάφορους τύπους όγκων έδειξαν ότι τα κακοήθη κύτταρα παρουσιάζουν συχνά μεγαλύτερη ποσότητα πρωτεΐνης AgNOR από τα αντίστοιχα μη κακοήθη. Οι NORs έχουν ισχυρή συσχέτιση με την μιτωτική δραστηριότητα του κυττάρου και επομένως χρησιμοποιούνται για να χαρακτηρίσουν ορισμένες νεοπλασίες. Η ποσοτικοποίηση των NORs γίνεται μορφομετρικά με την μελέτη της κατανομής του εμβαδού κάθε θετικά κεχρωσμένης περιοχής με την βοήθεια ηλεκτρονικού υπολογιστή (Trerè, 2000).

Εικ. 2. Καρκίνωμα του μαστού. Χρώση αργύρου για ανάδειξη των NORs (Trerè, 2000).

Άλλες χρώσεις στην ίδια κατηγορία περιλαμβάνουν την χρώση Grimelius για τα εκκριτικά κοκκία των νευροενδοκρινών κυττάρων, τις χρώσεις Warthin-Starry και Dieterle για την ανίχνευση σπειροχαίτων και άλλων βακτηρίων καθώς και την χρώση όξινης μελανίνης (Acid Melanin) για τα μελανώματα (Grizzle, 1996).

3. ΧΡΩΣΕΙΣ ΕΜΠΟΤΙΣΜΟΥ ΜΕ ΑΡΓΥΡΟ

Στις χρώσεις της κατηγορίας αυτής, το πρώτο βήμα είναι είτε μία αντίδραση παρόμοια με αυτήν της αργενταφφίνης, είτε η εμβάπτιση του δείγματος με συγκεκριμένα ανιόντα, συνήθως χρωμίου. Και στις δύο περιπτώσεις, η προσθήκη ιόντων αργύρου οδηγεί στο σχηματισμό συμπλόκων είτε με άλλα ιόντα αργύρου στην πρώτη περίπτωση, είτε με τα ανιόντα χρωμίου στην δεύτερη. Όπως και στις χρώσεις αργυρόφιλων δομών, έτσι και στις χρώσεις εμποτισμού με άργυρο, είναι απαραίτητη η χρήση μίας τρίτης ουσίας για να πραγματοποιηθεί η αναγωγή των ιόντων (Grizzle, 1996).

Οι χρώσεις της κατηγορίας αυτής χρησιμοποιούνται κυρίως για την ανάδειξη των νευρώνων του κεντρικού νευρικού συστήματος. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η χρώση Bielschowsky, ένα πολύτιμο εργαλείο για την μελέτη νευροεκφυλιστικών νόσων όπως η νόσος Alzheimer. Ειδικότερα, η χρώση αυτή χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό νευροϊνιδιακών κόμβων (neurofibrillary tangles) και πλακών αμυλοειδούς, που σχηματίζονται από την συσσώρευση της πρωτεΐνηςtau και του αμυλοειδούς-β αντίστοιχα (National Society for Histotechnology, 2021a). Από την αρχική δημοσίευση της μεθόδου από τον ομώνυμο επιστήμονα το 1908, το πρωτόκολλο της χρώσης έχει γνωρίσει αρκετές παραλλαγές, με μία από τις πιο γνωστές να είναι η “τροποποίηση” των Yamamoto-Hirano (Uchihara, 2007).

Εικ. 3 – Εγκέφαλος με εμφανείς κόμβους νευροϊνιδίων (βέλη) σε τροποποιημένη χρώση Bielschowsky (Yamamoto & Hirano, 1986).

4. ΧΡΩΣΕΙΣ ΟΞΕΙΔΟΑΝΑΓΩΓΗΣ

Η τελευταία κατηγορία χρώσεων αργύρου, περιλαμβάνει πρωτόκολλα τα οποία εμφανίζουν σημαντικές ομοιότητες με αυτά της πρώτης κατηγορίας. Μοναδική διαφορά είναι πως αντί να βασίζονται στην ύπαρξη αναγωγικών ομάδων στο δείγμα, χρησιμοποιούν ισχυρές οξειδωτικές ουσίες για να δημιουργήσουν τέτοιες ομάδες, οι οποίες με τη σειρά τους θα ανάξουν τα προστιθέμενα ιόντα αργύρου (Grizzle, 1996). Παραδείγματα χρώσεων αυτής της κατηγορίας είναι η χρώση Jones για βασικές μεμβράνες, η χρώση ρετικουλίνης για δικτυωτές ίνες και η Grocott’s Modified Gomori Methenamine-Silver (για συντομία Grocott’s Methenamine Silver, GMS) για μύκητες.

Από αυτές, η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη είναι η GMS, η οποία προσδίδει μαύρο χρώμα στους μύκητες και πράσινο στο υπόλοιπο δείγμα. Η ειδικότητά της, όμως, είναι χαμηλή, καθώς έχει αναφερθεί ότι, εκτός από μύκητες, μαύρο χρώμα αποκτούν επίσης και κύτταρα των βακτηρίων Nocardia spp, Bacillus cereus, Mycobacterium tuberculosis, τα έγκλειστα των κυττάρων μολυσμένων με κυτταρομεγαλοϊό, τα εσωτερικά όργανα των προνυμφών του Strongyloides stercoralis και το κυτταρόπλασμα των ουδετερόφιλων κυττάρων (Adhya, 2019, Wright et al., 2017). Ορισμένοι ερευνητές όμως υποστηρίζουν ότι το συγκεκριμένο χαρακτηριστικό της GMS δεν είναι αμιγώς αρνητικό, μιας και μπορεί να εφαρμοστεί διαγνωστικά στην ανεύρεση των προαναφερθέντων παθογόνων (Wright et al., 2017).

Εικ. 4 – Βιοψία οισοφάγου με GMS θετικές (σκούρο μωβ) ζύμες και ψευδοϋφές (Zhou, 2021).

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Συνοψίζοντας όσα προαναφέρθηκαν, οι χρώσεις αργύρου χρησιμοποιούνται ευρέως στην ιστοπαθολογία, για την ανίχνευση και το εντοπισμό μιας ποικιλίας κυτταρικών δομών, κυττάρων και μικροοργανισμών. Ο κοινός βιοχημικός μηχανισμός στον οποίο βασίζονται τα πρωτόκολλα, είναι η ικανότητα των ιόντων αργύρου, όταν ανάγονται, να σχηματίζουν μεταλλικά σύμπλοκα, διακριτά στο οπτικό μικροσκόπιο. Κάθε επιμέρους χρώση αυτής της μεγάλης ομάδας έχει τις δικές της ενδείξεις και αντενδείξεις, ενώ συνήθως υπάρχουν αρκετές παραλλαγές και τροποποιήσεις που αποσκοπούν στην βελτίωση της ειδικότητας και της ευαισθησίας της τεχνικής και στην επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων. Επομένως, ο ιστοπαθολόγος, θα πρέπει να επιλέξει την τεχνική που αρμόζει καλύτερα στο υπό μελέτη περιστατικό και θα προσφέρει τα πιο αξιόπιστα αποτελέσματα.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Adhya, A K, (2019). Grocott Methenamine Silver Positivity in Neutrophils. Journal of Cytology, 36(3), 184. https://doi.org/10.4103/JOC.JOC_134_18

2. Grizzle, W E, (1996). Theory and Practice of Silver Staining in Histopathology. Journal of Histotechnology, 19(3), 183-195. https://doi.org/10.1179/his.1996.19.3.183

3. National Society for Histotechnology, (2021). Bielschowsky’s Silver Stain for Alzheimer’s. https://www.nsh.org/blogs/nataliepaskoski/2021/05/14/bielschowskys-silver-stain-for-alzheimers

4. National Society for Histotechnology, (2021). Fontana Masson Stain. https://www.nsh.org/blogs/natalie-paskoski/2021/07/02/fontana-massonstain

5. Trerè, D, (2000). AgNOR staining and quantification. Micron, 31(2), 127- 131. https://doi.org/10.1016/s0968-4328(99)00069-4

6. Uchihara, T, (2007). Silver diagnosis in neuropathology: principles, practice and revised interpretation. Acta Neuropathologica, 113(5), 483- 499. https://doi.org/10.1007/s00401-007-0200-2

7. Wada, R, Nakano, N, Yajima, N, Yoneyama, T, Wakasaya, Y, Murakami, C, Yamato, K, & Yagihasi, S, (2008). Granulomatous prostatitis due to Cryptococcus neoformans: diagnostic usefulness of special stains and molecular analysis of 18S rDNA. Prostate Cancer and Prostatic Diseases, 11(2), 203-203. https://doi.org/10.1308/sj.pcan.4501031

8. Wright, A M, Mody, D R, Anton, R C, & Schwartz, M R, (2017). Aberrant staining with Grocott’s methenamine silver: utility beyond fungal organisms. Journal of the American Society of Cytopathology, 6(6), 223- 227. https://doi.org/10.1016/j.jasc.2017.05.004

9. Yamamoto, T, & Hirano, A, (1986). A Comparative Study of Modified Bielschowsky, Bodian and Thioflavin S Stains on Alzheimer’s Neurofibrillary Tangles. Neuropathology and Applied Neurobiology, 12(1), 3-9. https://doi.org/10.1111/j.1365-2990.1986.tb00677.x

10. Zhou, F, (2021, May 7). GMS. www.pathologyoutlines.com. https://www.pathologyoutlines.com/topic/stainsgms.html